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点击次数:221 发布时间:2020-05-27

(一)准备和安装guo滤器 

清洗好guo滤器,gan燥,放ru一张孔jing0.22μm的微孔聅iぃ貌及昂茫?5磅20 min进行高压灭jun处li。 zai超净tai内打开guo滤器架好,jiao管一duan接ru滤泵再插ru待除jun的液ti中,出口duanjiao管深rudao已xiao毒好的瓶子謝iaoS帽胓uo滤,guo滤后要jian查聅iな欠裢旰梦匏稹?nbsp;

(er)合成培养基的pei制

1、根据xi胞目录中的shuo明,按下biaoxuan择合适品pai及货号的培养基gan粉,用适量超纯水充分rongjie。

2、 按要求添加碳酸氢钠、谷氨酸钠、HEPES等,充分jiao拌shizhirongjie。

3、 调 pH至7.2zuo觵aoⅫ/p>

4、 加水至zuizhongti积。

5、 zai超净tai中对rong液进行滤guo除jun,分装ru250 mLhuo500 mL玻璃瓶中,用翻帽saisai紧瓶口。

6、 瓶口feng好,4℃冰箱贮存。 

(三)xiaoniuxue清的处li 

shi场上出售的xiaoniuxue清一般zuo了灭jun处li,danzaishi用前还yingzuo热灭活处li,即通guo加热的方法破huaibuti(近来也有guan点ren为热灭活处li是bubi要的)。tainiuxue清bubi灭活。

1、 将xue清加热至56℃并baochi30 min,其间要bu时qingqing晃dong,shi受热jun匀,防止沉淀析出。

2、 处li后的xue清贮存yu4℃。

3、 xiaoniuxue清zaishi用前进行筛xuan以掌握xue清的质量。

(si)sheng长培养基的pei制 

除无xue清培养zhi外,各zhong合成培养基zaishi用前需加ru一定量的xiaoniuxue清huotainiuxue清和抗jun素。 

培养基分装成xiao瓶(100~200 mL)襶uan鉺hi用,翻帽saisai紧瓶口。 

按ru下比例pei制: 基本培养基占80%~90%,xiaoniuxue清huotainiuxue清占10%~20%。 按1%ti积分数加ru双抗贮存液(青霉素+链霉素),shi青霉素和链霉素的zhong浓度分别为100 U/mL和100 μ/mL,。 

五)dong存xi胞的复苏 

ying遵守慢dongkuai融的原ze。先将水yu锅调至37-37。5度,取出dong存的xi胞迅速放ru后将xi胞面浸至水面以下bu断yaodong至融hua。 

zai无juntai内将完全培养基加ru50ml的xiao培养瓶内,约5mlzuo右,然后用无jun吸管从dong存管内取出xi胞,置培养并内qingqingyao晃,shixi胞jun匀后置培养箱内培养。

(六)传代、tie壁xi胞:

对yutie壁xi胞ying先吸(倒)尽培养基,吸的越gan净詊iao茫悦庵泻秃蠹觬u的xiaohua液,shi强度减弱(huoPBS洗1-3次)。50ml培养瓶加ruxiaohua液约1-3ml,按此比例进行xiaohua,(根据经验),晃dongshixiaohua液铺jun匀置37度培养箱约2-5穤hong樱迪录鹸i胞收缩变詁u蛏偈崖浜螅琿ingqing振dong瓶底shixi胞全部脱落,加ru2-3ml完全培养基后,qingqing吹打,shixi胞基本成单个悬fu,然后穤hong闷渌辥un培养瓶内,加ru完全培养基后继续培养huoshi验。 

悬fuxi胞:

一般传代可直接将xi胞原液穤hong闷渌嘌磕冢觬u完全培养基继续培养,ru要高浓度可先li心1000rpm,5min后加ru完全培养基,qingqing吹匀后,穤hong闷渌嘌磕诩觬u完全培养基继续培养。

(七)dong存 

将tie壁xi胞xiaohua后li心收ji,悬fuxi胞直接li心收ji,以完全培养基huotainiuxue清重悬xi胞至zhong浓度约106/ml。加ru10%的DMSO。以每管1~2ml分装至dong存管謝iaoS镁炔牧习?70摄氏度冰箱lingdong。次ribao存dao液氮謝iao?nbsp;

(八)注意事项
玻璃吸管和玻璃培养瓶的xiao毒:
1)高压zheng汽灭jun15穤hong右陨嘻
2)gan烤xiao毒140度2xiao时以上; 无jungong作tai先清洗后用75%jiu精擦拭gan净,紫外线照射40穤hong右陨嘻各zhong培养ban照射3xiao时以上; 培养基(pH7.2)和xue清pei制好后要zuo无jun试验:将xue清按10%加ru培养基内,用无jun的玻璃li心管huo玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天,rou眼见无浑浊huo沉淀等yi物。分装后置4度bao存; xiaohua液(pH7.8)huo其它加ru液,ying用高压zheng汽灭junhuo一次性无jun滤器guo滤除jun,分装成支置-20度bao存; 培养箱ying先用清水清洗后用75%jiu精擦拭一遍(ru有紫外线的ying照射1xiao时以上,ru有高温灭jun的ying按程序来jun)。至少每月一次。 

进rucao作时ying注意先清洗双手及手腕,然后用75%jiu精擦拭,cao作时注意无juntai内kong间层次。手及物品bu要zai暴露的瓶口上方来往,ru果数量较duo,培养瓶ying放zai与jiu精灯平行地方bianyucao作,瓶与瓶zhi间yingxiang隔一定的距li,开瓶(盖)时ying先用75%jiu精反复擦拭huo用灯烧,打开后ying用灯先烧口,然后烧盖。用完后同样cao作。整个cao作guo程尽量zai无juntai靠li面襤uai恪?nbsp;

 
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